Una especie de Protozoario ciliado en realidad eran dos especies distintas

Y técnicas útiles para el Naturalista y Zoólogo

Microscopios, colorantes, microscopios electrónicos, el SEM (Scanning Electron Microscope -microscopio electrónico de barrido), el DNA todos estos adelantos de la tecnología son muy útiles al zoólogo, especialmente al que estudia Protozoa o invertebrados muy pequeños, insectos también, pero la vista pura y simple también tiene su lugar, es útil para tener claro lo que estudiamos.

¿Ver los protozoarios, a simple vista, no son demasiado pequeños?

Perfectamente posible, si se sabe cómo.

Hace tiempo y allá lejos, cuando era estudiante en el Laboratorio de Zoología Invertebrados, Facultad de Humanidades y Ciencias, en Montevideo mi vista de cerca era excepcional.

De lejos yo no junaba nada, soy miope, pero de cerca el miope ve muy bien, mejor que las personas de vista ‘normal’.

Hay que saber presentar el objeto o medio a estudiar.

Para eso usaba unos frascos o tubos de sección cuadrada, no tan fáciles de encontrar.

Era especialmente útil una celda de cuarzo, prismática, descartada por estar algo cascada, de dos paredes despulidas y dos paredes de cuarzo muy transparente a la radiación visible, ultravioleta e infrarroja.

En la celda colocaba 5 ml de agua de charco o de río o de acequia, y lo iluminaba lateralmente, por las caras despulidas, simplemente al sol.

 

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La luz brillante revela a los protozoarios libres, nadando, un espectáculo apasionante.  Se ven en todo su color, y os juro que se ven los cilios vibrando y moviendo al animalito, se ven sus inclusiones, su núcleo, sus vacuolas Y SE VE TODO EN SU COLOR VERDADERO.

En esas condiciones ideales el ojo ve detalles de unas pocas micras, que luego pueden estudiarse y confirmarse al microscopio, fotografiarlo o dibujarlo  -el dibujo es el medio preferido y leal de presentar lo visto por el investigador, la fotografía tiene su lugar, pero no es lo único y a veces es inferior al dibujo.

☼  Si Uds quieren ver Protozoarios, y plancton marino a simple vista no es difícil

Esto va a ser su Celda de Observación.

1º Consigan un frasco o tubo de cristal boca ancha de paredes paralelas, no redondo, de 10 cms de alto, un par de cms de profundidad, eso aproximadamente. Si no tiene otra cosa le puede valer un tubo de ensayo grueso.

2º El material a observar: de un estanque permanente, una lagunita de un parque es ideal -el Parque Rodó es fenómeno, tiene lagos, así como corrientes de agua a modo de arroyitos, estatuas de Neptuno cubiertas de verdín- junte algas, hojas sumergidas, algún palito medio podrido, un poco de barro de bajo el agua, en un recipiente de plástico (no junte mucho, un poco alcanza y sobra) se lo lleva a su laboratorio. Junte también un frasco o botella con agua del lugar, el agua del grifo contiene cloro y va a matar a los bichos.

El material lo ponga en una cubeta de plástico ancha, un recipiente rectangular o un molde de hornear de cristal es perfecto, y le agrega un poco del agua, que apenas cubra.

Con una cucharita, o una pipeta gruesa ponga del agua que sobrenada el material, en la Celda de Observación, la examina en posición vertical.

3º Lo acerca a la ventana, que ilumine de cotelete, perdón, de costado y los verá nadar, resplandecientes.

 

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Esto es un grafismo, muy pobre, de lo que se puede ver en esas circunstancias, ya les digo que la realidad supera mucho esta imagen. Tengan en cuenta que estos bichitos unicelulares están vivos, se mueven, nada con rapidez y el dibujo no puede dar idea de sus brillantes cilios y flagelos que baten el agua y los envuelven en una vibración luminosa.

Con una lupa, instrumento que no le debe faltar al zoólogo y naturalista, los verá mejor aún.

No se ven tan grandes como en mi dibujo, pero se ven nadando y se notan detalles que un dibujo no puede mostrar.

4º  Para ver plancton marino.

Consiga una media de nailon vieja de su mamá. Hará un cono con ella, de casi un metro de largo por ejemplo.

A la boca ancha le cose como se dé maña, un anillo de alambre, de una percha por ejemplo.  Ate o le cosa tres cuerditas de un brazo de largo al aro -esto de las Ciencias Naturales no es cuestión de precisión, el Naturalista aficionado debe aguzar el ingenio. Y las ata con un nudo y le sujeta a una cuerdita algo más larga, metro y medio por ejemplo, alcanza, puede ser más larga. Esto es la Manga de colección, y necesita un recipiente al final donde caigan los bichitos.

4º b. Ahora tiene que hacerse el colector del plancton !  con un frasquito chico de plástico, mejor si es transparente. Las cápsulas de película Kodak eran perfectas.

Ahora sujeta ese Colector al cono y le advierto que es más difícil de lo que se pensaría, y lo tiene que sujetar muy bien porque va a estar sometido a cierta presión, al tirar de este copo colector por el agua de mar. Ate con alambre, use del Poxipol, hágale una jaulita con dos alambres para que no se pueda escapar, en fin, Ud mismo, ingéniese, pero que sea fuerte porque al tirar de la manga de colección el frasco al final no debe desprenderse.

Ça va sans dire, que venden colectores de plancton, cuestan caros.

4º c. Armado con su Manga de colección -o sea, el cono de seda o nailon con el frasquito Colector al final, y que tiene las cuerditas y la cuerda- se va al mar (ayuda si vive Ud cerca del mar) y si puede desde una barca, que no es tan fácil conseguir, o desde un muelle o desde las piedras no más, tira el artilugio al mar (le ate algún plomito para que se hunda algo) y recoge.

O nadando, a lo macho.

Al tirar del copo el agua se filtra por la seda y los organismos planctónicos -no los más microscópicos, pero aunque sean algo mayores igual interesantes – quedan retenidos, van al fondo, caen al frasquito colector que queda lleno de agua y se asombrará de la cantidad de bichitos que juntó. Por  supuesto que el tamaño de esos organismos es mayor que los poros de la manga de colección, los que son más chicos se escapan por los poros.

Si a Ud le interesan las diatomeas y similares, que realmente son de unas pocas micras de diámetro, va a necesitar un copo hecho de material de poro muy finito, y fue tradicional usar tela de molino de harina, pero probablemente en este caso deba comprar un colector especializado en diatomeas, acaba siendo lo más barato.

Junte varias colectas, las ponga en un frasco de un litro, y lo llene de agua, para que no se le mueran por el camino.

Si es de noche, o en una habitación a oscuras, espere a que los ojos se acostumbren y probablemente verá chispazos de luz en el frasco, son protozoarios marinos luminosos que al ser tocados por otros disparan su rayo de luz.

Los organismos colectados se pasan para ver mejor a su Celda de Observación y a luz lateral con o sin ayuda de una lupa, disfrute de verlos.

Trate de dibujarlos, y hoy en día hay aditamentos para cámaras e incluso para teléfonos móviles, que pueden permitir fotografiarlos en la Celda de Observación, tendrá que hacerle algún pequeño soporte a la Celda y la cámara en algún trípode, en fin, la fotografía es una técnica apasionante, hoy mucho más sencilla y barata que cuando yo investigaba.

5º Otra forma, incluso más simple y casi garantizado que encontrará especies nuevas para la Ciencia, es ir al mar, puede ser también algún arroyo, juntar piedras chicas de debajo del agua, algún mejillón, arrancarlo; en fin, si Ud se anima a hacer un poco de buceo a pulmón libre, con una máscara y snorkel y patas de rana, junta de alguna roca y algas del fondo, una piedra con una actinia las mete rápido en una bolsa de plástico que no huyan los bichos y en la orilla las pone en una cubeta para mirar ya, o en un recipiente grande que llene de agua para llevárselo, o rasca de la mufa que hay en las piedras que trajo del fondo, y las pone en el frasco..

Luego observa con atención los organismos que sobrenadan, puede pasar a la cubeta de plástico y ver si algo interesa.

☼ Lo anterior era para interesarle a Ud en algunos métodos simples de colecta y observación del Naturalista y Zoólogo, y para que entienda mejor porqué yo usaba la vista directa para investigar, y recién después los métodos de la Microscopía.

☼ Para fijar y conservar los organismos colectados, use una mezcla de alcohol + glicerina + formol, por ejemplo alcohol 100 ml, glicerina 10 ml, formol 5 ml, A+G+F eso en un frasco bien cerrado.

Los organismos seleccionados se meten en pequeños tubitos de cristal, se llenan del líquido conservador A+G+F, y se tapan con un corchito o tapón -algunos usan simplemente algódón para taparlos- y se meten en un frasco más grande boca ancha, con A+G+F, bien cerrado con una tapa que no pierda y se guardan en un armario bien ventilado -no en su dormitorio ! Los vapores del AGF son un poco tóxicos. Si lo que le interesa más son pequeños crustáceos, copépodos y otros artrópodos, la mezcla A+G (sin formol) es superior, no se les rompen las patitas.

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Cómo se planteó el problema a investigar

El Dr Fernando Mañé-Garzón, director del Laboratorio de Zoología Invertebrados (luego Departamento de) de la Facultad de Humanidades y Ciencias [probablemente o con toda seguridad, bajo su dirección, fue el mejor organismo de investigación de invertebrados no insectos, de todo el mundo de habla hispana, y que descubrió numerosas especies nuevas para la ciencia, además de trabajos de fisiología y ecología ] me comentó que muchos años antes un trabajo publicado por el Dr. Cordero, que había sido director del Museo de Historia Natural, suponía que una especie de Ciliado presente en el intestino de un caracol de río del Uruguay, la Ampullaria canaliculata (hoy la llaman Pomacea canaliculata) podía tratarse en realidad de dos especies distintas, y que se podía investigar eso.

Cordero había usado un método tradicional entre los histólogos médicos, cortes de material fijado en bloques de parafina, y coloreado con hematoxilina – eosina y al microscopio.

Esto a veces causa confusión, así que ya inspirado por mi observación de protozoarios vivos procedo a conseguir el material.

Voy a mi lugar preferido de colección, el Parque Rodó y su lago (Cordero había hecho lo mismo) y en el estanque donde está la estatua de Neptuno junto de Ampullarias y plantas acuáticas perfectamente familiares para el que tenga acuario de agua dulce.

Las ampullarias (generalmente pronunciado «ampularias») eran muy estudiadas en el laboratorio, porque en su cámara respiratoria, una cosa entre pulmón y branquia, viven Temnocéfalos (1), unos pequeños gusanos platelmintos muy interesantes.

En el laboratorio procedo a la vivisección del caracol este, separo el intestino lleno de material vegetal semidigerido y lo coloco en un pequeño recipiente de cristal, algo así como un bloque de cristal con una cavidad del tamaño y forma de un cristal de reloj, con algo de agua limpia.

Abriendo con dos agujas enmangadas, el contenido queda libre, y lo estudio usando una lupa binocular, esencialmente es como un microscopio pero de bajo aumento, con dos objetivos y dos oculares que permite ver en tres dimensiones y campo visual amplio.

(busquen en Google «lupa binocular» abundancia de artículos y de fotos, y videos en YouTube enseñan a usarla)

Aquí un modelo de Nikon de por esa época, que tiene un tercer tubo donde se puede enchufar una cámara fotográfica

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La lupa binocular confirmó lo que yo veía en la cubeta y a simple vista, que eran dos diferentes protozoarios, uno con forma de perita, y otro con forma de zapatilla, ¡y el perita era transparente y el zapatilla era rojo !

Eso jamás se pudiera ver ya fijados y coloreados, mucho menos en cortes en parafina y coloreados con hematoxilina-eosina.

Cuando se los mostré al profesor Mañé-Garzón, los mira, y levanta los ojos del microscopio, con una expresión de exaltada alegría y sorpresa en la cara del Maestro que se deshizo en expresiones entusiasmadas ante el descubrimiento.

Ahora venía la tarea difícil, transformar este hallazgo en un trabajo científico digno de publicación.

Seleccioné y limpié el material a fijar. Para ello me hice un pequeño colador, con un tapón de plástico y una malla metálica. Al pasar del material, los restos del intestino del caracol y restos vegetales, quedaban retenidos, los protozoarios limpios caían al otro recipiente.  Extraje del líquido sobrante con una pipeta y vierto del líquido fijador, en algunos casos era el AGF, en otros casos otros fijadores más complicados.

En ocasiones levantaba los protozoarios CON LA MANO, es decir, no son tan pequeños como se puede pensar, y mi pulso es o era excelente, y usando una aguja enmangada, que me hice con un resorte muy finito de acero, de un reloj viejo y enchapado en oro era el resorte, corté unos trozos y los enmango en varios manguitos pequeños.

Con ayuda de la lupa binocular, y a pulso, los levantaba y transporto a portaobjetos, para fijarlos pegados ahí,  y trabajar con ellos.

Un método usual es algo de albúmina de huevo sobre el portaobjeto, o incluso el líquido pegajoso de un ajo cortado, se pasa el protozoario (o puede ser otro pequeño invertebrado, un gusanito ya fijado) o pueden ser varios, y una vez bien pegado pero no del todo seco, se gotea del colorante que vamos a usar según técnica ya conocida y practicada, y se puede luego someter a cuidadosos lavados para extraer el exceso de colorante, deshidratar con alcohol absoluto, diferenciar luego y aclarar (se usa xilol, a veces aceite de clavo) y se pone una gota de Bálsamo del Canadá y un cubreobjeto y se deja secar un día o algo, para que se pueda observar ya al potente microscopio óptico.

Acá, como ya sabemos lo que tenemos, porque lo hemos visto bien con los ojos, se puede usar la hematoxilina eosina como colorante (la hematoxilina da un color negro azulado, y la eosina rosado, eso da contrastes entre el núcleo y otras partes del organismo), o el simple carmín acético o carmín al alumbre, usual en microscopía contrastado con algún colorante verde o azul.

Esto permite examinar muy bien los núcleos -los Ciliados tienen dos núcleos, no uno. Un micronúcleo y un macronúcleo, incluso en el primer grafismo que puse se ven algunos con esa característica.  Pero no permite ver las cilias; bien, las cilias o cilios son invisibles al microscopio óptico, demasiado pequeñas, pero los cuerpos basales que cada cilia tiene en la membrana del ciliado, se pueden ver al microscopio, pero no con estos colorantes normales que nombré, hay que usar la técnica especial con el nitrato de plata, esa que era tan amada por Don Santiago Ramón y Cajal.

La cosa es que no teníamos ninguna experiencia en Coloraciones con Plata, y mucho menos para Protozoarios, era necesario que me enseñara a hacerlo yo mismo. Un estudio de la literatura científica me llevó a diseñar el siguiente procedimiento, y lo hice con éxito.

* Fijación.  Coloco abundantes ejemplares de los ciliados en una gota en un portaobjeto. Una gota pequeña, que no se caiga, y la extiendo con otro porta, así queda una lámina

¡El siguiente paso es MUY peligroso!  Debe hacerse en cámara con extractor de gases y conducto al exterior.  Puede hacerse al aire libre, pero tenga cuidado de no aspirar los vapores.

Se pone Ácido Nítrico puro en un Vaso de Bohemia (beaker en inglés llamado) de poco diámetro, y se coloca el portaobjeto (o varios) dado vuelta, sobre la boca, con los protozoarios todavía vivos y nadando en el líquido.

Echar alambre de cobre en el ácido nítrico puro !  Desprende vapores rutilantes que alcanzan los portaobjetos y fijan instantáneamente los protozoarios  –cuidado, le pueden destruir a Ud los pulmones, es brutalmente reactivo., por eso lo de hacerlo en cámara con extractor de gases, en que Ud sólo mete las manos para trabajar y está protegido por un cristal, y el extractor se lleva los gases de la cámara.  Esto es usual en Laboratorio de Química y no hay uno que no tenga, o no sería laboratorio de Química.

Ahora los portaobjetos se dejan secar al aire.

* Coloración al Nitrato de Plata.  Se gotea con cuidado Nitrato de Plata de concentración entre 1% a 3% da buen resultado, sobre los portaobjetos. Inmediatamente se saca la placa con los portas (yo usaba una placa de cartón con ranuras adecuadas, se puede hacer uno eso con facilidad) y se expone al Sol.

Cuando se ve que el material tomó un color marrón visible a simple vista, se sacan del sol, y dentro en el laboratorio se quita el exceso de nitrato de plata, goteando agua destilada o alcohol sobre los portas, inclinados sobre la pileta, o sobre un recipiente apropiado, que se lo lleve.

Se deja secar al aire.

En realidad este procedimiento es un poco brutal, y muchos ejemplares quedan destruidos por la técnica, pero como hay tantos protozoarios de entrada, algunos quedan muy  bien coloreados.

Se examinan con microscopio, objetivo de inmersión en aceite, a la máxima ampliación x1000 o más.

* Los laboratorios más avanzados fijan con glutaraldehido (otro gas reactivo brutal, o sea que las mismas precauciones, y colorean con proteinatos de plata. El resultado es más confiable, aunque a fin de cuentas es el mismo pero más caro y difícil.  Por ejemplo acá,

IMPROVEMENT OF SILVER IMPREGNATION TECHNIQUE (PROTARGOL) TO OBTAIN MORPHOLOGICAL FEATURES OF PROTISTS CILIATES, FLAGELLATES AND OPALINATES

☼ Luego corresponde dibujar -la fotografía al microscopio ahora es más fácil, pero el dibujo sigue siendo imprescindible-, estudiar el organismo, consultar la bibliografía, establecer hipótesis de trabajo, llegar a conclusiones y publicarlo.

Acá las dos especies que encontramos.

Parasicuophora ampullariarum (Cordero, 1928)

Decidimos que esta era la especie descrita por El Dr Cordero en 1928

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Y creamos una Nueva Especie, Parasicuophora corderoi  .

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 Biometría

Ahora medí a los animalitos, con sus longitudes totales, y del peristoma (la «boca»), medias y desvíos standard, presentados de forma gráfica, para que se note que son poblaciones diferentes, son especies diferentes.

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☼ Luego lo publicamos,

1975. Dos ciliados del género Parasicuophora parásitos de Pomacea  canaliculata (Lamarck).
Revista de Biología del Uruguay, vol. 3, pp. 11-125 (1975)

☼ Estas dos especies aparecen citadas en el Global Names Index

http://gni.globalnames.org/name_strings?page=3867&search_term=ns%3APAR*

Parasicuophora ampullariarum (Cordero 1928)
Parasicuophora corderoi Gascon 1975

☼ Hay varias referencias en la literatura científica a mi trabajo, por ejemplo,

http://eurekamag.com/research/004/534/004534688.php

Gascon, A., 1975: 2 ciliates of the genus parasicuophora parasitic on pomacea canaliculata. Revista de Biologia del Uruguay 3(2): 111-126

Nyctotherus ampullariarum (Cordero, 1928) is redescribed and transferred to the genus Parasicuophora (Albaret) [P. ampullariarum comb. nov.], Parasicuophora corderoi sp. nov. is described from the same host. Both species are clearly distinguished by the shape of the macronucleus, general body form and size and form of the peristome and infundibulum.

☼ CONCLUSIÓN

Queda evidente que la observación de los protozoarios in vivo y al ojo libre, da grandes satisfacciones y permite enfocar la investigación zoológica en la dirección productiva, para el investigador y el naturalista.

 

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(2) Temnocéfalos (artículo de Wikipedia, en francés)

Les Temnocephalida sont un ordre de vers plats.

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Escrito bajo el signo de Sagitario,

 © 2014 Armando Gascón Lozano

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Por Armando

3 comentarios en «Cómo aclaré una confusión zoológica»
  1. Para los amantes de los libros antiguos, existe una web magnífica: http://www.biolib.de/
    Es alemana, y tiene libros clásicos de biología escaneados (en pdf) y enlaces hacia escaneos de altísima calidad.
    Por ejemplo, se pueden ver y descargar con paciencia, los tratados, magníficos de Ernest Haeckel:
    – Radiolarien (láminas preciosas sobre ese tipo de microorganismos), http://caliban.mpipz.mpg.de/haeckel/radiolarien/index.html
    – Kunstformen der Natur (formas de arte en la naturaleza): http://caliban.mpipz.mpg.de/haeckel/kunstformen/index.html
    Allá hay material como para pasarse horas y horas…
    Saludos.

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